视网膜色素上皮细胞培养基筛选及其相关生长因子的影响

摘要：目的:通过研究肿瘤坏死因子(TNF-α),血管内皮生长因子(VEGF)、β成纤维细胞生长因子(βFGF)、转移生长因子β2 (TGFβ2)、干扰素-γ(IFN-γ)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Casepase-3)在不同浓度胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)与胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠(insulin-transferrin-sodium selenite,ITS)混合培养基中的表达及其对正常视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞生长的影响以探索维持正常RPE细胞生长的理想培养基.方法:首先分别在不含RPE细胞和DMEM培养基的20,40,100mL/L FBS和10,20,30g/L ITS中检测TNF-α, VEGF、βFGF、TGFβ2、IFN-γ及Casepase-3是否存在.然后取四十只C57 BL/6系小鼠眼的RPE细胞分别培养于含20,40,100mL/L FBS以及20,40,100mL/L FBS与10g/L ITS分别组合的DMEM培养基中.免疫组织化学染色以及细胞计数鉴定、评估RPE细胞的存在与生长状况.采用原代培养48h的第三代、第四代RPE细胞,分别用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及酶联免疫吸附(ELISA)法检测RPE细胞和上清液中TNF-α, VEGF、βFGF、TGFβ2、IFN-γ及casepase-3的表达强弱;用蛋白印记(Western blotting)法检测RPE细胞中Casepase-3的表达.结果:在20,40,100mL/L FBS中检测到了TNF-α, VEGF、βFGF、TGFβ2及casepase-3 (IFN-γ没有表达)并且随浓度增加而表达上调.在10,20,30g/L ITS中没有检测到上述生长因子.RPE细胞培养成功.在含20,40,100mL/L不同浓度的FBS以及20,40,100mL/L FBS与10g/L ITS分别组合的DMEM培养基中随浓度增加,TNF-α, VEGF、βFGF、TGFβ2及casepase-3的表达呈上调趋势,各对应组组间的表达强度没有明显差异,但不同浓度组组内的表达强度有明显差异(P＜0.01).IFN-γ没有表达.上述因子在含20mL/L FBS与20mL/L FBS +10g/L ITS的培养基中表达低,但20mL/L FBS +10g/L ITS的培养基中RPE细胞生长良好.结论:在RPE细胞和上清液中有TNF-α, VEGF、βFGF、TGFβ2及casepase-3的表达.20mL/L FBS +10g/L ITS的混合培养基可能是维持正常RPE细胞生长的一种理想培养基.